紫外-可見分光光度法是在190～800nm波長范圍內來測定物質的吸光度，用于鑒別、雜質檢查和定量測定的方法。同時也是一種是涵蓋臨床檢驗在內的價廉、快速、高靈敏度的常用定量分析方法之一。利用被測物質對光的吸收特征和吸收強度，對物質進行定性、定量分析的一種分析方法，是在比色的基礎上所發(fā)展起來的。紫外-可見分光光度法廣泛用于金屬、合金、鋼鐵、化工產品、生物材料、食品、臨床和環(huán)境樣品以及藥物中微量無機物和有機物的測定。

【資料圖】

描述物質分子對輻射的吸收程度隨波長變化的函數(shù)關系曲線即為吸收光譜，物質的吸收光譜具有與其結構相關的特征性。當光穿過被測物質溶液時，物質對光的吸收程度隨光的波長不同而變化，因此能夠通過測定物質在不同波長處的吸光度，來繪制其吸光度與波長的關系圖即得被測物質的吸收光譜。

從吸收光譜中，可以確定最大吸收波長λ_max和最小吸收波長λ_min，隨后即可通過特定波長范圍內樣品的光譜與對照光譜或對照品光譜的比較，或通過確定最大吸收波長，或通過測量兩個特定波長處的吸光度比值而鑒別物質。在用于定量時，在最大吸收波長處測量一定濃度樣品溶液的吸光度，并與一定濃度的對照溶液的吸光度進行比較或采用吸收系數(shù)法求算出樣品溶液的濃度。

以下是在使用紫外-可見分光光度法時對溶劑、測定方以及儀器方面的要求及校正和檢定。

使用紫外-可見分光光度法時對溶劑的要求

1.當有機溶劑含有雜原子時，通常具有很強的末端吸收。因此，要將其當作溶劑使用時，它們的使用范圍均不能小于截止使用波長，例如甲醇、乙醇的截止使用波長為205nm；

2.當溶劑不純時，可能會增加干擾吸收。因此，在測定供試品前，應先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長附近是否符合要求，即將溶劑置1cm石英吸收池中，以空氣為空白(即空白光路中不置任何物質)測定其吸光度；

3.溶劑和吸收池的吸光度要求在220～240nm范圍內不得超過0.40，在241～250nm范圍內不得超過0.20，在251～300nm范圍內不得超過0.10，在300nm以上時不得超過0.05。

測定時的注意事項

1.在測定時，通常需以配置供試品溶液的同批溶劑為空白對照，使用1cm的石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰波長±2nm以內測試幾個點的吸光度，或由儀器在規(guī)定波長附近自動掃描測定，以核對供試品的吸收峰波長位置是否正確。并且吸收峰波長應在該品種項下規(guī)定的波長±2nm以內，并以吸光度最大的波長作為測定波長。一般供試品溶液的吸光度讀數(shù)，以在0.3～0.7之間為宜；

2.儀器的狹縫波帶寬度宜小于供試品吸收帶的半高寬度的1/10，否則測得的吸光度會偏低，因此選擇狹縫寬度的時候，應以減小狹縫寬度時供試品的吸光度不再增大為準；

3.由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，在測定供試品的吸光度后應減去空白讀數(shù)，或由儀器自動扣除空白讀數(shù)后再計算含量；

4.當溶液的pH值對測定結果有影響時，應將供試品溶液的pH值和對照品溶液的pH值調成一致。

測定法含量檢測一般有對照品比較法、吸收系數(shù)法、計算分光光度法以及比色法。

1.對照品比較法：按各品種項下的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分規(guī)定量的100%±10%，所用溶劑也應完全一致，在規(guī)定的波長測定供試品溶液和對照品溶液的吸光度后，按下式計算供試品中被測溶液的濃度：c_x=(A_x/A_r)c_r。式中c_x為供試品溶液的濃度；A_x為供試品溶液的吸光度；c_r為對照品溶液的濃度；A_r為對照品溶液的吸光度。

2.吸收系數(shù)法：按各品種項下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測定其吸光度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計算含量。用本法測定時，吸收系數(shù)通常應大于100，并注意儀器的校正和檢定。

3.計算分光光度法：計算分光光度法有多種，使用時應按各品種項下規(guī)定的方法進行。當吸光度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測定時，波長的微小變化可能對測定結果造成顯著影響，故對照品和供試品的測試條件應盡可能一致。計算分光光度法一般不宜用作含量測定。

4.比色法：供試品本身在紫外-可見光區(qū)沒有強吸收，或在紫外光區(qū)雖有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當?shù)娘@色劑，使反應產物的最大吸收移至可見光區(qū)，這種測定方法稱為比色法。用比色法測定時，應取數(shù)份梯度量的對照品溶液，用溶劑補充至同一體積，顯色后，以相應試劑為空白，在各品種規(guī)定的波長處測定各份溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，再根據(jù)供試品的吸光度在標準曲線上查得其相應的濃度，并求出其含量。也可取對照品溶液與供試品溶液同時操作，顯色后，以相應的試劑為空白，在各品種規(guī)定的波長處測定對照品和供試品溶液的吸光度，按對照品比較法計算供試品溶液的濃度。

使用紫外-可見分光光度法的儀器校正及檢定

1. 波長：由于環(huán)境因素對機械部分的影響，儀器的波長經常會略有變動，因此除應定期對所用的儀器進行全面校正檢定外，還應于測定前校正測定波長。儀器波長的允許誤差為：紫外光區(qū)±lnm，500nm附近±2nm。

(1)常用汞燈中的較強譜線237.83nm，253.65nm，275.28nm，296.73nm，313.16nm，334.15nm，365.02nm，404.66nm，435.83nm，546.07nm與576.96nm；

(2)用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm譜線進行校正；

(3)鈥玻璃在波長279.4nm，287.5nm，333.7nm，360.9nm，418.5nm，460.0nm，484.5nm，536.2nm與637.5nm處有尖銳吸收峰，也可作波長校正用，需注意鈥玻璃會因來源不同或隨著時間的推移會有微小的變化；

(4)高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器以10%高氯酸溶液為溶劑，配制含氧化鈥(Ho2O3)4%的溶液，該溶液的吸收峰波長為241.13nm，278.10nm，287.18nm，333.44nm，345.47nm，361.31nm，416.28nm，451.30nm，485.29nm，536.64nm和640.52nm。

2.吸光度的準確度：可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。取在120℃干燥至恒重的基準重鉻酸鉀約60mg，精密稱定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀釋至1000ml，在規(guī)定的波長處測定并計算其吸收系數(shù)，并與規(guī)定的吸收系數(shù)比較，應符合表中的規(guī)定。

3.雜散光的檢查：可按下表所列的試劑和濃度，配制成水溶液，置1cm石英吸收池中，在規(guī)定的波長處測定透光率，應符合表中的規(guī)定。

關鍵詞： 分光光度法 吸收系數(shù) 不得超過